無菌檢查方法——薄膜過濾法

根據2020年版《中華人民共和國藥典》的規定，當供試品的性質允許時，包括能直接過濾或者經過處理后能過濾的供試品，應采用薄膜過濾法進行無菌檢查。薄膜過濾法能有效去除藥物中的抗菌成分，而細菌及其他微生物則會留在過濾器上。通過對殘留微生物的培養，促進其生長與繁殖，定性或定量檢測微生物 。

薄膜過濾法一般采用封閉式薄膜過濾器，根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質，對水溶性液體供試品、水溶性固體和半固體供試品、非水溶性供試品、可溶于十四烷酸異丙醇的膏劑和黏性油劑供試品、無菌氣霧劑供試品、裝有藥物的注射器供試品、具有導管的醫療器械（輸血、輸液袋等）供試品等多種特性試樣進行無菌檢查。

無菌檢查需要滿足的檢測環境要求

無菌檢查應在無菌條件下進行，試驗環境必須達到無菌檢查的要求，檢驗全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。日常檢驗需對試驗環境進行監測。通常采用的檢測環境有以下兩種：

1. B級潔凈度背景下，局部單向流級潔凈度空氣區域的檢測環境；

2. 一般區/CNC/D級潔凈度背景下，采用經驗證合格的級潔凈度單向流無菌隔離系統的檢測環境。

單向流空氣區域、工作臺面及受控環境應定期按醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現行國家標準進行潔凈度確認。

薄膜過濾法常見問題匯總

01

供試品溶解

在進行固體注射劑（例如密封瓶粉針劑）的無菌檢查時，需先將其溶解、轉移并適當稀釋，隨后通過薄膜過濾法進行過濾處理。在進行溶液與稀釋時，溶劑及稀釋液的選擇、配比以及振蕩器的應用等因素，均會對供試品的溶解效率與過濾效果產生直接影響。

根據2020年版《中國藥典》四部無菌檢查法的規定，推薦的稀釋液包括0.1%無菌蛋白胨水溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液以及0.9%無菌氯化鈉溶液。實驗研究顯示，采用前兩種稀釋液時，微生物的回收率顯著高于使用0.9%無菌氯化鈉溶液。若供試品未能充分溶解，過濾時濾膜將會吸附大量供試品顆粒，即便經過多次沖洗，這些被吸附的供試品仍難以清除，殘留在濾膜上的供試品會導致陽性菌不能在規定的條件下生長。

02

集菌培養器選擇不當

為了避免操作過程中的人為污染和偏差，多數實驗室傾向于采用一次性全封閉集菌培養器對供試品溶液進行過濾。在選擇全封閉集菌培養器時，濾膜的材質、孔徑及其與供試品的相容性成為影響試驗結果的關鍵要素。為確保微生物能被有效截留而不受供試品或其溶劑的干擾，特別是考慮到某些注射劑具有抑菌性并易于被濾膜吸附，應選用具有疏水性邊緣和低吸附特性的濾膜，例如尼龍膜材質的集菌器。無菌檢查中使用的薄膜過濾器濾膜孔徑應不超過0.45微米，此孔徑能有效捕獲微生物。同時，每片濾膜的總過濾量需控制在合理范圍內，以防微生物受損。

市場上一次性全封閉集菌培養器的品牌、型號及規格繁多，適用于不同類型的產品。例如，安瓿瓶裝藥液，可選用配備加長型取樣針的集菌培養器，無需額外轉移樣品，即可快速完成檢品的轉移；西林瓶裝粉劑則可選擇雙針座設計的集菌培養器，提供全封閉溶解方案，實現溶解、過濾、沖洗的一體化操作，避免轉移步驟；對于需稀釋的西林瓶裝抑菌性粉劑，三針座設計的集菌培養器更為合適，它集成了溶解、稀釋、過濾、沖洗的全過程，有助于降低抑菌成分濃度，減少吸附。

檢驗人員在挑選集菌培養器時，需綜合考慮產品的溶解度、抑菌程度等因素，以確保達到預期的過濾效果。不當的選擇可能導致沖洗液用量增加，進而影響檢驗結果的可靠性。

03

沖洗方法不具體

某些注射劑具有較強的抑菌作用，因此，在供試液過濾后，還需通過沖洗液進行沖洗，以消除其抑菌效果。然而，一些無菌方法驗證報告中的試驗操作步驟描述得過于簡略，僅僅列出了沖洗量和沖洗次數，卻未詳細記錄沖洗量的確定過程，也未注明沖洗時的流速。事實上，沖洗流速對實驗結果具有重要影響：流速過慢可能無法沖洗掉抑菌成分，從而無法有效消除供試品的抑菌作用；而流速過快則可能損傷微生物，導致檢驗結果無法真實反映供試品的無菌狀態。因此，在進行無菌檢查時，應詳細記錄沖洗量的確定過程，并嚴格控制沖洗流速，以確保實驗結果的準確性和可靠性。

04

培養基儲存不當

適用性檢查合格的培養基，若儲存不當，會導致其質量下降，甚至變得不合格，進而影響無菌試驗結果的準確性。以無菌檢查中常用的硫乙醇酸鹽流體培養基為例，該培養基能在普通有氧環境中提供厭氧條件，支持需氧菌和厭氧菌的良好生長，且便于觀察試驗結果。根據2020年版《中華人民共和國藥典》四部規定，在供試品接種前，培養基的氧化層高度應不超過培養基深度的1/3，培養結束后則不應超過1/2。這一要求旨在確保培養基的厭氧層能滿足厭氧菌的生長條件。

培養基氧化層的高度受儲存條件的影響。不同實驗室根據培養基的使用量，會采取不同的儲存方式。對于使用量較大的實驗室，可能會選擇大批量配制后，采用無菌灌裝并在容器內填充氮氣、壓蓋，然后在2～25℃的溫度范圍內儲存。而使用量較小的實驗室，則可能采用硅膠塞及紗布包裹瓶口滅菌后，在2～8℃的溫度下避光保存。無論采取何種儲存方式，都需要進行相關的驗證，以確定最佳的保存條件，從而確保培養基的質量始終符合要求。

05

酶的活性降低

在抗生素類注射劑的無菌檢查中，針對抑菌作用較強的β-內酰胺類抗生素，除了應用薄膜過濾法外，還可結合使用中和劑β-內酰胺酶，以更有效地消除供試品的抑菌活性。具體操作時，在供試品經過過濾和沖洗后，向集菌器中的培養基內加入β-內酰胺酶，以此中和那些即便經過沖洗仍少量吸附于濾膜上、未能去除的供試品活性。β-內酰胺酶的使用不僅能減少沖洗液的總量和沖洗次數，還能防止濾膜上的微生物受損。

值得注意的是，β-內酰胺酶的儲存條件對其活力至關重要，通常應在2～8℃下保存。儲存溫度的變化會直接影響酶的活性，因此，實驗室在使用此類酶時，必須嚴格遵循產品說明進行儲存，密切關注儲存溫度和時長對酶活性的影響。若儲存不當導致酶活性降低，而仍按標示酶活性計算加入量，則可能無法消除供試品的抗菌作用，從而影響無菌檢查的準確性。

06

陽性對照菌未按要求加入規定量

2020年版《中國藥典》明確要求，根據供試品的特性來選定陽性對照菌。在制備陽性對照實驗的菌液時，其方法與方法適用性實驗相同，且規定的加菌量不得超過100 cfu。然而，部分廠家為了節省成本，檢驗人員會采用新鮮液體培養基制備菌液，并在初次檢測菌液含菌量符合標準后，便將其儲存于4℃冰箱中供后續多次使用。在這些后續的使用過程中，檢驗人員并未每次都重新檢測所加入菌液的具體含量，而是直接按照使用時的量來添加。這種做法可能導致實際加入的陽性對照菌量遠超規定值，甚至達到規定量的幾倍。盡管在這些條件下陽性菌能夠良好生長，使得實驗表面上看似成立，但實際上卻掩蓋了實驗可能存在的問題，導致了實驗結果的誤導性。